1.1

摘要

核酸是一个生物大分子化合物由许多核酸聚合而成，是生命最基本的物质之一。核酸广泛存在于所有动物、植物细胞、微生物和生物体中核酸常与蛋白质结合形成核蛋白。不同的核酸，其化学成分、核酸排列顺序都不同。根据化学组成的不同，核酸可分为核糖核酸，简称RNA和脱氧核糖核酸，简称DNA。

DNA是储存、复制和传递遗传信息的主要物质基础，RNA在蛋白质的合成中起着重要作用，其中转运核糖核酸，简称t RNA起着携带和转运活性氨基酸的作用:m RNA是合成蛋白质的模板；核糖体核糖核酸，简称r RNA，是细胞合成蛋白质的主要场所。

1.2

核酸提取样本

普通样本:血液、动植物组织、细菌、细胞、病毒、骨髓、体液等。

问题:唾液、痰、土壤、粪便、毛发、石蜡包埋组织、骨骼、牙齿、指甲、烟头等。

1.3

核酸提取方法

核酸包括DNA和RNA，两者都是以与蛋白质结合的状态存在于细胞中。核酸提取的主要步骤是:裂解细胞去除与核酸结合的蛋白质、多糖、脂类等生物大分子，去除其他不需要的核酸。沉淀核酸 纯化 核酸，去除盐类、有机试剂等杂质。

1.3.1碱裂解法

碱裂解法是基于DNA变性和复性的差异来达到分离目的。

1.3.2.煮沸法

煮沸时，样品中的DNA pass 核酸裂解物被释放出来。离心沉淀后去除杂质，上清液可用于PCR扩增。

1.3.3浓盐法

由于RNA和DNA在电解质溶液中的溶解度不同，所以将两者分开。常用的方法是用1M氯化钠提取它们，用含有少量辛醇的氯仿摇匀DNP粘液，乳化，然后离心除去蛋白质。此时蛋白凝胶停留在水相和氯仿相的中间，而DNA位于上层水相，2倍体积为95。

1.3.4苯酚提取法

苯酚作为蛋白质变性剂，同时抑制脱氧核糖核酸酶的降解。当匀浆用苯酚处理时，由于蛋白质与DNA之间的键被打破，蛋白质分子表面出现许多类似苯酚的极性基团。分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心后，取出水层，重复操作多次，然后合并含有DNA的水相，利用核酸不溶的性质，用乙醇沉淀DNA。此时DNA是一种非常粘稠的物质，可以用玻璃慢慢绕成一团取出。这种方法的特点是将提取的DNA保持在自然状态。

1.3.5水浸提法

利用核酸的水溶性，将组织细胞破碎，然后用低盐溶液除去RNA，再将沉淀物溶于水，使DNA完全溶于水。离心后，收集上清液，向上清液中加入固体氯化钠以将其调节至2。6M。加入2倍体积的95%乙醇，立即用搅拌法搅拌，然后用80%和95%乙醇和丙酸铜洗涤，*后在空气中干燥，得到DNA sample。这种方法提取的DNA中蛋白质含量较高，一般不使用。为了去除蛋白质，可以对这种方法进行改进，在提取过程中加入SDS。

1.3.6阴离子洗涤剂法

DNA可用SDS或二甲苯钠等去污剂使蛋白质变性，直接从生物材料中提取。因为细胞DNA和蛋白质之间往往是通过静电引力或配位键结合，又因为阴离子去污剂可以破坏这种价键，所以经常使用阴离子去污剂萃取DNA。

1.3.7硅胶薄膜法

可用于手动提取或自动提取。

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硅胶模法核酸萃取

1.3.8磁珠法

生物磁珠是一种新型的功能化固体载体，表面包覆有活性基团，可与多种生物活性物质偶联，具有液体流动性和固体磁性材料等特点，一般用于自动提取。它们可以在外磁场的作用下沿方向移动和停留，在去除外磁场后稍加振荡或抽吸就可以均匀地分散在液体中，使固液相的分离变得非常快速和方便，通过简单的洗脱就可以得到高纯度的目标物。

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磁珠法核酸提取

1.4

提取纯化方法比较

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1.5

提取核酸的目的

高质量地提取核酸分子的完整性和纯度是下游分子生物学实验的基础。因此，高质量地提取核酸非常重要。他可以做很多很多的分子生物学实验。下面简单介绍一下常见的分子生物学实验。

1.5.1个PCR

聚合酶链式反应(简称PCR)是一种分子生物学技术，利用扩增技术扩增特定的DNA片段。可视为特殊DNA体外复制。PCR(聚合酶链式反应)的原理是DNA在体外95℃变性会变成单链，在低温下(一般在60℃左右)，引物会根据互补碱基配对的原理与单链结合，然后将温度调整到DNA聚合酶的最适反应温度(72℃左右)，DNA聚合。基于聚合酶的PCR仪实际上是一个温控装置，可以在变性温度、复性温度和延伸温度之间进行很好的控制。

1.5.2转基因

转基因是将基因片段转移到特定生物体内，最终获得具有特定遗传性状的个体的技术。无论转移的基因距离进化树中的物种有多远，接受者都可以读取它，因为DNA是一个通用代码，细胞知道如何读取它。即使是关系最遥远的物种，如人类和细菌，也有许多共同的基因，这些基因在数十亿年的进化中保持不变。基因从哪里来不重要，发挥的是功能，所以转入动物基因的植物不会有动物的味道。

转基因技术的理论基础来自于进化衍生的分子生物学。基因片段的来源可以是提取特定生物基因组所需的目的基因，也可以是人工合成的具有特定序列的基因片段。将基因片段转入特定生物体内，与自身基因组重组，然后从重组体中人工选择几代，获得具有特定遗传性状的个体。这项技术可以使重组生物增加人们所期望的新性状，培育新品种。

1.5 .3基因文库的构建

一个生物体的基因组DNA用限制性内切酶部分消化后，将消化的片段插入到载体DNA分子中，所有这些插入了基因组DNA片段的载体分子的集合体将包含该生物体的全部基因组，即构成该生物体的基因文库。将这些载体引入受体细菌或细胞，使得每个细胞包含基因组DNA片段和载体重组DNA分子。经过繁殖和扩增后，许多细胞一起包含了生物体的全部基因组序列。我们称这种集合体为基因库。

利用重组DNA技术，将某一生物细胞的total DNA或染色体DNA的所有片段随机连接到基因载体上，然后转入合适的宿主细胞，通过细胞增殖形成每个片段的无性克隆(克隆)。当制备的克隆数量足够大以包括某一生物体的所有基因时，整组克隆是相同的定义也适用于生物体的线粒体DNA或叶绿体DNA的基因文库。因为制备DNA片段的分界点是随机的，所以每个克隆中包含的DNA片段可能是一个或几个基因、一个基因的一部分或除了完整基因之外的两侧相邻的DNA序列。

1.5.4分子测序

用DNA聚合酶合成与模板互补的DNA链，在三维空间记录模板位置和核苷酸序列信息，然后逆向构建模板的序列。除了DNA合成反应的三要素(模板、酶、核苷酸)外，反应循环中单色荧光标记的模板位置和核苷酸的序列(a、c、g、t如何)也是最终DNA序列要完成的关键要素。如果反应中使用的核苷酸标记了四种不同的荧光，就需要在每个反应循环中切换不同波长的光来记录不同的碱基。

1.5.5分子诊断

分子诊断:利用分子生物学方法检测患者体内遗传物质的结构或表达水平的变化来做出诊断的技术，称为分子诊断。分子诊断是预测性诊断的主要方法，既可用于个体遗传病的诊断，也可用于产前诊断。用于分子诊断的材料包括DNA、RNA和蛋白质。

分子诊断主要是指检测编码与疾病相关的各种结构蛋白、酶、抗原、抗体和免疫活性分子的基因。

1.5.6亲子鉴定

亲子鉴定是运用法医学、生物学、遗传学的理论和技术，从子代与父母的形态结构或生理功能的相似特征来分析遗传特征，确定父母与子女的生物学关系是否是法医物证鉴定的主要组成部分。亲子鉴定从中国古代就有了，比如血滴、骨滴。

DNA亲子鉴定的操作步骤如下:

第一步:DNA提取

提取样品细胞核中含有的DNA，然后进行一定的纯化，去除样品中的杂质。

第二步:PCR扩增

PCR的中文名字叫聚合酶链式反应。简单来说，华科基因PCR扩增的步骤就是通过酶促反应，在PCR仪上大量复制出我们需要的片段，并放大到一些特殊仪器可以看到的程度。

步骤3:后PCR反应

这一步主要是ABI测序仪检测的准备阶段，在此阶段打开双链DNA并加入一些检测用的内标，主要是标记检测片段的长度。

步骤4:毛细管测序仪检测。

由于DNA是带电的，通过毛细管电泳，不同的片段DNA电泳速度不同，在相同的电压和相同的电泳时间下，泳动距离不同，可以通过前期加入的内标测量来区分，并通过一定的软件显示在电脑上，方便检测人员处理和分析数据。

第五步:分析数据，出具报告。

主要是检测人员对结果进行分析、汇总、计算，然后做出鉴定结论和报告。

1.5.7法医鉴定

司法鉴定是司法程序中技术工作的重要组成部分。它是运用医学、生物学、人类学、物理学、化学等知识对活体、尸体以及与人有关的生物证据进行检验和鉴定。，从而得出死因、损伤程度、凶器类型、血型分析、事实确认等结论性意见。司法鉴定结论是三大诉讼法中的重要证据类型。由于与人身密切相关，司法鉴定在诉讼和非诉讼活动中具有重要意义。它是查明案件事实、区分案件性质的重要依据，也是鉴定案件中其他证据是否真实的重要手段。可以说，法医工作的质量在一定程度上影响着司法公正。

1.5.8基因敲除

基因敲除是指一种基因工程技术，针对序列已知但功能未知的序列，改变生物的遗传基因，使特定基因的功能失效，从而阻断部分功能并进一步影响生物，进而推断基因的生物学功能。

基因敲除和基因嵌入技术是20世纪90年代出现的*新外源DNA导入技术。基因敲除是一种基因打靶技术，类似于基因的同源重组。指外源DNA基因与受体细胞基因组中相同或相似序列的同源重组，从而替换受体细胞基因组中相同/相似的基因序列，并整合入受体细胞基因组。该方法能产生准确的基因突变，并能正确纠正生物体的基因突变。基因嵌入又称基因置换，是利用内源基因序列两侧或外侧的断点，将内源基因替换为同源序列的目的基因。目前基因敲除和基因嵌入技术有Cre/Lox P系统、FLPI系统等。

1.5.9基因芯片

基因芯片(genechip，又称DNA chip和生物芯片)的雏形于20世纪80年代中期提出。基因芯片的测序原理是杂交测序法，即核酸测序法通过与一组核酸已知序列的探针杂交，将8 核苷酸已知序列的探针固定在一个基片表面。当溶液中带有荧光标记的核酸序列TATGCAATCTAG与基因芯片上相应位置的核酸探针互补时，通过确定荧光强度*强的探针的位置，可以得到一组序列完全互补的探针序列。据此可以重组target 核酸的序列。

1.5.10 .动植物资源保存鉴定

毫无疑问，建立濒危野生动植物种质基因库，实施濒危动植物基因保护工程，对于我国濒危野生动植物的保护和繁衍，对于维护我们赖以生存的环境生物多样性和生态链平衡具有重要意义。然而，对于已经进入生物经济时代的人类来说，其意义远不止于此。

高质量核酸的提取在其他领域和方向也不容小觑。但是，仅仅依靠传统的核酸提取方式，很难满足日益庞大的中文核酸市场。所以全自动 核酸自动提取器的出现，会给中国核酸提取器市场带来光明。